L'examen microscopique en lumière réfléchie en biologie

Habituellement, les objets microscopiques sont observés en lames minces éclairés par transparence. Il n'y a qu'aux faibles (<100x) grossissements des microscopes stéréoscopiques que l'on observe en éclairant par dessus de coté. La métallographie fait exception et la surface des échantillons aplanis y est éclairée par des dispositifs spéciaux qui illuminent dans l'axe de visée le sujet par un miroir semi transparent. Pour essayer ces dispositifs en biologie, j'ai d'abord acquis en occasion ce microscope métallographique Olympus BHC. Le dispositif d'éclairage est visible au dessus à gauche en noir. Il allonge le trajet optique de 4 cm et les objectifs M (5,10,20 et 40x) semblent parfocaux pour la longueur de tube de 20cm (au lieu de 16 habituellement). A la différence des objectifs habituels; ils sont calculés pour l'observation sans lamelle. La lumière d'éclairage passant par l'objectif et y revenant directement , c'est un dispositif dit "à fond clair"

J'ai essayé d'abord de regarder des objets adaptés, type surfaces métalliques comme des pièces de monnaie,
puis des objets plans comme cette feuille de papier imprimée.

	obj.5x; h=0,36mm	obj.10x; h=0,18mm	obj.20x; h=0,09mm
(images très agrandies du fait du petit capteur de la caméra vidéo utilisée)

Mais mon but est de réaliser des observations d'objets biologiques.
J'ai d'abord testé des feuilles de la fougère polypode et des ailes du papillon paon de jour.

objectif 40x dans les deux images; scan de dias 24x36.

Ce système permet d'atteindre des grosssissements beaucoup plus élevés que les microscopes stéréoscopiques. Mais la distance de travail très courte nécessite des précautions et il apparait un problème du aux irrégularités des sujets biologiques: des reflets abaissent le contraste de l'image. Le travail en lumière polarisée les atténue beaucoup et donc est souhaitable.
D'autre part, la profondeur de champ est très faible.
Ces difficultés expliquent le faible succès de ce système parmi les biologistes. Bien sur par rapport à des images de microscopie électronique à balayage, la netteté manque ! Mais c'est en vraies couleurs et nécessite très peu de préparation.

En avril 2002, j'ai complèté le jeu d'objectif avec un 1,3x trouvé en occasion. Il donne un champ observé de 15mm. Malheureusement j'ai eu la déception de découvrir qu'il n'est pas parfocal avec les autres et nécessite une distance de travail élevée (presque 5cm) peu pratique... Il est aussi plus sensible aux reflets et en pratique il faut l'utiliser en lumière polarisée avec l'épiilluminateur.

Je souhaitais essayer l'éclairage "en fond noir" , supposé moins sensible aux réflexions. En octobre 2003, j'ai pu trouver en occasion avec l'illuminateur épiscopique adapté, un jeu d'objectifs permettant le fond noir en lumière réfléchie avec mon microscope Olympus.

En fond noir, cela signifie que la lumière éclairant le sujet ne rentre pas dans l'objectif d'observation. Cela passe par une optique d'éclairage en anneau autour de chaque objectif dont le diamètre est plus grand que la norme RMS par conséquent. (d'ou la nécessité d'un revolver porte objectifs spécifique) Ce sont aussi contrairement à mes autres objectifs, des optiques "à l'infini" dont la lentille de focalisation est dans l'illuminateur. Voici mieux qu'un texte, un schéma de ce système d'éclairage:

Comparaison de l'aspect du mème sujet (poussières sur film diapo noir) en épiscopie
fond clair		fond noir

Manifestement, le rendu du fond noir est plus naturel. En fond clair, la surface brillante du film apparait grise.

De plus, l'éclairage en fond noir supprime les réflexions gènantes qui nécessitent la polarisation en fond clair. L'image correspond à celle d'un stéréomicoscope, (le relief en moins!), mais avec des grossissements le dépassant (de 100x à 500X).
C'est donc une découverte naturelle de détails d'objets non préparés qui est rendue possible.

Malheureusement, la très faible distance de travail des objectifs forts ne permet guère de les utiliser avec des sujets naturels non aplanis.
(pour le 20x, avec 1mm, c'est encore utilisable, pour le 50x, avec 0,3mm, c'est ingèrable avec des sujets non plans)
Il me faudra un objectif à longue distance de travail!
Par ailleurs, la profondeur de champ est toujours extrèmement faible.

Malgré ces difficultés, voici quelques tests.

Voici des détails d'une feuille de Pelargonium en fond clair et en fond noir (objectif 10x)
Quand un arrière plan est présent, le fond noir me semble plus flatteur. Mais les poils se détachent très bien aussi en fond clair.
Sur ces vues de la face inférieure, les reflets sur les cellules en fond clair sont atténués en fond noir. La faible profondeur de champ reste un handicap. Les poils dressés apparaissent flous.

Le bon piqué obtenu sur ces écailles de papillon et l'aspect naturel du sujet en fond noir, m'incitent à poursuivre mes essais!

A l'automne 2004, je vais le faire d'autant plus que j'ai trouvé un statif simillaire avec un objectif 50x à longue distance de travail.

Faites des sugestions à l'auteur: <Daniel Nardin>

Dernière avancée: 15 septembre 2004